citofluorimetria a flusso

CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO: COS' E'

La citofluorimetria a flusso è una metodica che permette di valutare alcuni parametri fisici, chimici di particelle contenute in una sospensione. Tramite l'uso di una luce laser e di rilevatori ottici, il sistema raccoglie la fluorescenza emessa da un fluorocromo (sostanza organica in grado di emettere una fluorescenza se opportunamente eccitata) legato ad un anticorpo monoclonale specifico per i recettori di superficie e/o intracitoplasmatici delle cellule (CD): il segnale raccolto viene, quindi, convertito in un segnale elettronico e rappresentato in grafico

I diversi gruppi di anticorpi monoclonali, capaci di riconoscere specificatamente una molecola, sono stati denominati "cluster of differentation" (CD) e codificati con un numero (es. CD4), che ne indica la funzione: ad esempio la molecola CD4 è associata ai linfociti T helper, mentre la CD8 è presente sulla superficie dei linfociti T citotossici. Quindi, posto che, la fluorescenza misurata e' proporzionale all'espressione cellulare dei recettori, e' possibile definire l'espressione fenotipica delle diverse popolazioni cellulari. Attualmente in medicina veterinaria sono disponibili alcuni anticorpi monoclonali, riportati nella tabella a fine pagina.

Per comprendere a pieno l'utilità di tale metodica pensiamo a un caso di linfoma: mediante l'impiego del CD3 e del CD79 è possibile tipizzarlo, ovvero individuare l'origine T o B. Come dimostrato dalla letteratura più aggiornata, alla maggior parte dei linfomi di tipo B è associata una migliore prognosi rispetto a quelli T (pur con alcune eccezioni) Nell'ambito delle neoplasie emopoietiche la citofluorimetria fornisce poi un supporto diagnostico ineguagliabile, in quanto permette un riconoscimento certo, anche quando le caratteristiche citomorfologiche non sono inequivocabili.

• Linfoma B e T
• Leucemie linfocitiche acute e croniche (LLA-LLC)
• Leucemie mieloidi acute (vedi nostro case report del 2010) e leucemie mielomonocitiche (AML-AML4)
• Leucemia megacariocitica acuta (AML 7)
• Istiocitosi maligna (MH)
• Rapporto CD4/CD8 nel gatto affetto da FIV
• Rapporto CD4/CD8 nel cane affetto da Leishmaniosi
• Trombocitopenie immunomediate. Si segnala che nel Cavalier King Charles Spaniel è possibile riscontrare degli anticorpi anti-PLT in assenza di malattia immunomediata. Si suggerisce di contattare il Laboratorio per un inquadramento clinico del paziente. 
• Anemie immunomediate
• Deficit dell'adesione leucocitaria 

Per approfondire l'argomento vi suggeriamo di leggere il nostro importante lavoro scientifico del 2009 dedicato alla tipizzazione delle leucemie con la metodica citofluorimetrica (link esterno al sito di Veterinary Clinical Pathology).

Raccolta ed invio dei campioni

Indicare sempre specie, razza, età e sospetto diagnostico
 

Il test si esegue per la diagnosi delle anemie immuno-mediate e sostituisce il test di Coombs. Inviare sangue intero in K3EDTA. I campioni devono arrivare al Laboratorio entro 24-36h dal prelievo. Mantenere a temperatura ambiente. Nei mesi estivi però conviene inserire nel pacchetto un siberino, per evitare un surriscaldamento. Comunque evitare un contatto diretto tra campione e siberino.

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Ricerca degli anticorpi anti-piastrine
Il test si esegue per la diagnosi delle trombocitopenie immunomediate. Inviare sangue intero con sodio citrato (la provetta che utilizzate per il profilo coagulativo, ma che in questo caso non deve essere centrifugata). La provetta deve contenere almeno 3 ml di sangue citratato. I campioni devono arrivare al Laboratorio entro 24-36h dal prelievo. Mantenere a temperatura ambiente. Nei mesi estivi però conviene inserire nel pacchetto un siberino, per evitare un surriscaldamento. Comunque evitare un contatto diretto tra campione e siberino.

Inviare una provetta di sangue e/o succo midollare in K3EDTA. Per una completa valutazione è indispensabile una contestuale valutazione ematologica. Si consiglia pertanto di allegare un esame emocromocitometrico e/o un esame citologico del midollo.

 

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Linfonodo (per la valutazione dell'immunofenotipo B o T)

1. Richiedere al laboratorio una provetta di trasporto, che contiene una soluzione tampone (PBS – phosphate buffered saline)
2. Eseguire un’agoinfissione linfonodale
3. Spruzzare delicatamente il materiale dentro le provette di PBS (almeno 3) 
4. Delicatamente aspirare il liquido così allestito e dispensare nuovamente nella provetta per sciacquare l’ago
5. Far giungere al laboratorio entro 24-36h dal campionamento, non refrigerato

N.B. Nel caso in cui la diagnosi citologica di linfoma non sia stata eseguita presso il nostro laboratorio, verranno fornite le sole percentuali dei diversi marcatori senza alcun commento, poiché la sola metodica può risultare non sufficiente nella discriminazione dei diversi disordini linfoproliferativi. Il personale rimane tuttavia a disposizione nell’interpretazione del referto

 

ANTICORPO MOLECOLE CORRELATE:

CD 3 TCR Complex
CD 5 Linfociti maturi e timociti
CD 34 Precursori mieloidi e linfoidi
CD 45 Leucociti
CD 79 BCR complex & linfociti B in tutte le fasi maturative